分子印迹聚合物微球制备及其对5<i>α</i>胆甾烷吸附性能研究

原陇苗; 马荣; 陈建珍; 邵媛媛; 吴应琴

doi:10.11781/sysydz2024051098

分子印迹聚合物微球制备及其对5α胆甾烷吸附性能研究

doi: 10.11781/sysydz2024051098

原陇苗^1,,
马荣¹,
陈建珍^{1, 2},
邵媛媛^{1, 2},
吴应琴^1, ,

1.
中国科学院西北生态环境资源研究院/甘肃省油气资源勘探与评价重点实验室, 兰州 730000
2.
中国科学院大学, 北京 100049

基金项目:

国家自然科学基金 42072180

国家自然科学基金 41772147

国家自然科学基金 41272147

中国科学院仪器设备功能开发技术创新项目 E0280101

详细信息

作者简介:
原陇苗(1994—), 女, 博士生, 从事油气地球化学研究。E-mail: ylm7321@163.com

通讯作者:
吴应琴(1971—), 女, 教授级高级工程师, 博士生导师, 从事油气地球化学、环境地球化学研究。E-mail: yingqinwu@lzb.ac.cn

中图分类号: TE135
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出版历程
- 收稿日期: 2023-09-15
- 修回日期: 2024-06-29
- 刊出日期: 2024-09-28

Preparation of molecularly imprinted polymer microspheres and their adsorption performance for 5α-cholestane

YUAN Longmiao^1
,,
MA Rong¹,
CHEN Jianzhen^{1, 2},
SHAO Yuanyuan^{1, 2},
WU Yingqin^{1
, ,}

1.
Northwest Institute of Eco-Environment and Resources, Chinese Academy of Sciences/Key Laboratory of Petroleum Resources Exploration and Evaluation of Gansu Province, Lanzhou, Gansu 730000, China
2.
University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China

摘要

摘要: 采用沉淀聚合法，以胆固醇、去氧胆酸、β-谷固醇为虚拟模板，丙烯酸(AA)为功能单体，偶氮二异丁腈(AIBN)为引发剂，乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)为交联剂，制备甾烷类分子印迹聚合物(MIPs)和空白分子印迹聚合物(NIP)。采用扫描电子显微镜(SEM)、X射线光谱(XRD)、傅里叶变换红外光谱(FT-IR)和比表面积(BET)表征聚合物形貌和结构，并考察其对甾烷类物质的吸附性能。分析结果表明，甾烷类分子印迹聚合物尺寸均一、分散性好，是表面密布孔穴的球形纳米颗粒。吸附性能研究结果表明，MIPs对5α-胆甾烷的吸附能力明显强于NIP，且三种MIPs相比，去氧胆酸、β-谷固醇分子印迹聚合物对5α-胆甾烷的吸附强于胆固醇分子印迹聚合物。通过吸附动力学研究发现，MIPs对5α-胆甾烷的吸附过程符合准二级动力学模型，主要受化学吸附控制；MIPs和NIP的等温吸附符合Langmuir等温吸附模型和Scatchard模型，表明MIPs对5α-胆甾烷具有特异选择性吸附能力，且吸附过程属于单分子层吸附，最大吸附量为0.735 mg/g。表明胆固醇、去氧胆酸、β-谷固醇三种虚拟分子印迹聚合物均对5α-胆甾烷具有较高的分子识别能力及选择性。
- 甾烷类化合物 /
- 分子印迹聚合物 /
- 吸附性能 /
- 模板分子 /
- 功能单体
Abstract: Steroidal molecularly imprinted polymers (MIPs) and non-imprinted polymer (NIP) were prepared by precipitation polymerization method using cholesterol, deoxycholic acid, and β-sitosterol as the virtual templates, acrylic acid (AA) as the functional monomer, azobisisobutyronitrile (AIBN) as the initiator, and ethylene glycol dimethacrylate (EGDMA) as the cross-linking agent. The morphology and structure of the polymers were characterized using scanning electron microscopy (SEM), X-ray spectroscopy (XRD), Fourier-transform infrared spectroscopy (FT-IR), and Brunauer-Emmett-Teller (BET) specific surface area analysis. The adsorption performance for steroidal substances was also investigated. The results showed that the steroidal MIPs were uniformly-sized and well-dispersed spherical nanoparticles with porous surface. Adsorption performance results showed that MIPs had significantly stronger adsorption capacities for 5α-cholestane compared to NIP. Among the three MIPs, deoxycholic acid and β-sitosterol MIPs demonstrated stronger adsorption capacities for 5α-cholestane than that of cholesterol. The adsorption kinetics studies showed that the adsorption process of MIPs for 5α-cholestane was in accordance with the pseudo-second-order kinetic model, which was mainly controlled by chemisorption. The isothermal adsorption of both MIPs and NIP conformed to the Langmuir isothermal adsorption model and the Scatchard model, indicating that MIPs exhibited specific selective adsorption for 5α-cholestane and that the adsorption process was monolayer adsorption, with a maximum adsorption capacity of 0.735 mg/g. The study suggests that MIPs prepared with cholesterol, deoxycholic acid, and β-sitosterol as virtual templates have high molecular recognition and selectivity for 5α-cholestane.
- steroidal compounds /
- molecularly imprinted polymers /
- adsorption performance /
- template molecules /
- functional monomers
注释:

利益冲突声明/Conflict of Interests

所有作者声明不存在利益冲突。

All authors disclose no relevant conflict of interests.

作者贡献/Authors’Contributions

原陇苗参与实验设计；陈建珍和马荣完成实验操作；原陇苗、邵媛媛和吴应琴参与论文写作与修改。所有作者均阅读并同意最终稿件的提交。

The study was designed by YUAN Longmiao. The experimental operation was completed by CHEN Jianzhen and MA Rong. The manuscript was drafted and revised by YUAN Longmiao, SHAO Yuanyuan, and WU Yingqin. All authors have read the last version of the paper and consented to its submission.

HTML全文

随着石油勘探的不断深入，深层—超深层油气已成为全球油气勘探领域的焦点^[1-3]。甾烷类化合物由于其分子结构稳定，基本保留原始生物碳骨架^[4]，因此可作为评估原油和烃源岩的生物标志化合物之一，对于评价油气形成和成藏具有重要的指导意义。然而，值得注意的是，深层—超深层原油通常源自多套烃源岩，原油成熟度较高，且随着深度的增加，地层温度逐渐升高，生标裂解导致待测的生物标志物含量极低，这使得其难以达到进行组分和同位素分析所需的最低检测限^[5-6]。因此，迫切需要探索一种高效、快速且具有强选择性的新型材料，用于富集和分离痕量甾烷类化合物，为深层—超深层油气勘探提供科学依据。为了实现甾烷类化合物的有效富集，我们可以将分子印迹技术(Molecular Imprinting Technology，MIT)引入到痕量及超痕量生物标志化合物的研究领域^[7]。已有研究表明，碳基分子印迹聚合物对油品中的有机噻吩类硫化物具有优先选择识别吸附能力，能够对噻吩类硫化物进行专一性富集及脱除^[8]；同时也有报道初步指出，分子印迹技术在识别分析甾类化合物中应用前景较好^[9]。这一方法有望为深层—超深层油气田样品中痕量甾烷类化合物组分及同位素分析提供创新性的解决方案，从而为深层—超深层油气勘探提供科学支持。

利用分子印迹技术制备的分子印迹聚合物(Molecularly Imprinted Polymers，MIPs)可通过印迹分子留下的特异性印迹孔穴对其分子进行选择性识别^[7]，已在色谱^[9]、制药^[10]、有机环境^[11]、化学分析^[12]等领域广泛应用，其待测物检出限可达到10^-12~10^-10级。然而分子印迹聚合物的制备受到多种因素的影响，例如聚合时间、温度、交联剂用量、溶剂体积等^[13-14]。因此，对于MIPs的制备条件进行优化至关重要。此外，MIPs的制备主要依赖于功能单体和模板分子之间的非共价键相互作用，这包括氢键、静电作用、离子对、疏水作用等^[14-17]。氢键由于其相对较弱的键能，使模板分子在分子印迹聚合物中易于去除，并且能够通过多个作用位点提高对目标分子的识别性能和选择性吸附^[18-19]。

张圣祖等 ^[20]利用分子印迹技术，根据甾体类化合物中存在的羟基取代基，与功能单体(如丙烯酸、甲基丙烯酸、甲基丙烯酸甲酯)之间形成氢键或酯键(硼酸酯键或碳酸酯键)，成功制备出对特定甾体化合物的高效识别MIPs。此外，研究还表明这些MIPs具有吸附速率快、吸附能力强等优点^[21-23]。为了研究甾烷类化合物的富集和识别，本研究以胆固醇、β-谷固醇和去氧胆酸为虚拟模板，通过在乙腈溶液中引入功能单体丙烯酸(AA)和交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)，采用沉淀聚合法制备了分子印迹聚合物。随后，对制备过程中的聚合时间、温度以及交联剂用量等关键条件进行系统优化，以合成具有最佳性能的分子印迹聚合物。此外开展了最优分子印迹聚合物和相应的空白聚合物对5α-胆甾烷的吸附性能研究，并用动力学模型和等温线模型(Scatchard模型、Langmuir模型和Freundlich模型)揭示其吸附过程和吸附机理，旨在深入理解甾烷类化合物的富集和识别机制，为分子印迹聚合物在深层—超深层油源对比领域的应用提供科学依据。

1. 实验部分

1.1 试剂与仪器

本研究使用的实验试剂包括5α-胆甾烷、胆固醇、β-谷固醇、去氧胆酸、丙烯酸、引发剂偶氮二异丁腈(AIBN)以及交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)(结构式详见表 1)。实验过程中采用的仪器包括紫外可见光度计、电热恒温干燥箱、恒温培养振荡器、超声波清洗器以及气相色谱—质谱联用仪(GC-MS)(表 2)

表 1 实验试剂

Table 1. Experimental reagents

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表 2 实验仪器

Table 2. Experimental apparatus

实验仪器	型号	生产厂家
紫外可见光度计	UV-2600	谱质分析检测技术(上海)有限公司
电热恒温干燥箱	XMA-2000	泰科施普(北京)技术有限公司
恒温培养振荡器	HNY-100β	天津市欧诺仪器仪表有限公司
超声波清洗器	KQ5200 E	昆山市超声仪器有限公司
傅里叶红外光谱仪	Bruker Alpha	泰科施普(北京)技术有限公司
场发射扫描电子显微镜	Merlin Compact	德国蔡司
GC-MS	HP Agilent 6890/5737	美国安捷伦科技有限公司

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1.2 MIPs制备和优化

(1) 将0.5 mmol的胆固醇、β-谷固醇、去氧胆酸和2mmol的丙烯酸依次加入含60mL乙腈的三角烧瓶(250 mL)中，超声25 min，随后静置2 h，依次加入10 mmol乙二醇二甲基丙烯酸酯和160.5 mg偶氮二异丁腈，混合后继续超声25 min，氮吹15 min后脱氧密封，并在60 ℃水浴下热聚合24 h，聚合反应结束后静置冷却、离心、干燥。随后用滤纸包裹干燥后的聚合物，放入索氏提取器中，配制甲醇—乙酸混合溶液(V∶V=9∶1)索氏抽提28 h，再用甲醇反复抽提13 h。经干燥处理24 h后收集获得胆固醇、去氧胆酸、β-谷固醇虚拟印迹分子聚合物MIP1、MIP2和MIP3。除不加模板分子外，对照聚合物(NIP)的合成方法与MIPs相同(图 1)。

图 1 分子印迹聚合物的聚合方案

Figure 1. Polymerization scheme for MIPs

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(2) 为优化MIPs的制备条件，在制备过程中，设置MIP1、MIP2、MIP3及NIP在不同聚合时间(12、16、20、24、28 h)、温度(50、60、70 ℃)以及EGDMA用量[5、10、15、20 mmol，使得n(模板分子)∶n(AA)∶n(EGDMA)=1∶4∶10、1∶4∶20、1∶4∶30、1∶4∶40]，监测恒温水浴锅中的聚合溶液的表观变化，筛选最佳的聚合时间、温度以及交联剂用量。

1.3 MIPs表征

(1) 扫描电镜(SEM)：首先采用SEM对合成的MIPs进行微观形貌表征，将待测样品均匀涂敷在导电胶上，采用离子溅射仪对MIPs喷碳，然后利用扫描电镜(加速电压10.00 kV)观察MIPs和NIP的表面形貌。

(2) 比表面积(BET)：称取1~1.5 g样品，在200 ℃条件下脱气8 h，利用N₂吸附—脱附实验确定MIPs的比表面积和孔径分布。

(3) 红外光谱(FT-IR)：利用傅里叶变换红外光谱仪(FT-IR)对固体模板胆固醇、去氧胆酸、β-谷固醇及合成的MIP1、MIP2、MIP3和NIP的化学结构进行表征，采用溴化钾压片法，将固体样品和溴化钾粉末按1∶100的比例研磨均匀，利用压片器得到薄片，在4 000~500 cm^-1波长范围内进行光谱扫描。

(4) X射线衍射(XRD)：采用X射线衍射(XRD)对MIPs进行X衍射图谱测试，将小于200目的样品制成表面平整的试片，随后将制好的试片放入衍射仪中分析聚合物的结构及结晶状态[Cu Ka辐射源(A=1.541 9 A°)，扫描范围为3°~80°，扫描速度为5°/min]。

1.4 MIPs结合吸附实验

分别称取10.0 mg的MIPs、NIP到玻璃离心管中，加入浓度5.0 mg/L的5α-胆甾烷—甲醇溶液，封口混合均匀，恒温振荡24 h，离心后用0.22 μm孔径的滤膜过滤取得上清液，进行GC-MS分析。根据标准曲线和吸附后的溶液峰面积，计算MIPs和NIP的吸附量(Q)、印迹因子(IF)及分配常数(K)。

1.5 吸附动力学实验

为了研究MIP1、MIP2、MIP3及NIP的结合动力学，预先配制浓度为5.0 mg/L的5α-胆甾烷—甲醇溶液，选择一组对应的MIPs和NIP，称取10.0 mg的MIPs和NIP，分别置于10 mL具塞离心管中，加入5 ml浓度为5 mg/L的备用溶液，每组设置三个平行，并架于振荡器上循环振荡吸附，在不同的吸附时间下(10、40、70、130、190、250、340 min)，离心10 min后用0.22 μm孔径的滤膜过滤取得上清液，用GC-MS测定其浓度，并计算其吸附量。

1.6 等温吸附实验

称取10.00 mg的MIPs和NIP，分别置于10 mL规格的具塞离心管中，加入5 mL不同浓度的(1、3、5、7、9、11 mg/L)5α-胆甾烷—甲醇溶液，每组设置三个平行，并在室温下将混合物振荡吸附到平衡后离心分离，用0.22 μm孔径滤膜过滤。通过GC-MS测定上清液中5α-胆甾烷残留量，并计算其吸附量，绘制吸附等温线。

1.7 MIPs分离饱和烃中甾烷组分

将2.0g的MIPs用正己烷浸泡后，在直径为1.0cm的固相萃取空柱中装柱，柱高6 cm。将1 mL原油饱和烃溶液上样，用10 mL正己烷淋洗饱和烃中的其他组分，收集淋洗液。之后用甲醇∶乙酸=9∶1的混合溶液洗脱吸附于MIPs上的甾烷类物质，收集洗脱液。最后用GC-MS分析淋洗液和洗脱液中各组分的浓度。具体的淋洗和洗脱过程见图 2。

图 2 分子印迹聚合物对甾烷类物质的分离及纯化

Figure 2. Isolation and purification of steroidal compounds by MIPs

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1.8 GC-MS测定条件

色谱条件：进样口温度250 ℃，HP-5MS柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，起始温度100 ℃(恒温5 min)，以20 ℃/min升至280 ℃(恒温10 min)。无分流进样，进样量2 μL。

质谱条件：增强型EI源，电离能量70 eV，四极杆温度150 ℃，离子源温度230 ℃，质量范围50~650 amu，谱库为NIST11，扫描方式为全扫描。

1.9 数据处理及分析

在特异性吸附实验中，计算MIPs和NIP的吸附量(Q)、印迹因子(IF)及分配常数(K)的公式如下^[24]：

$Q=\left(C_0-C_{\mathrm{f}}\right) V / M$

(1)

$K_{\mathrm{D}}=Q / C_{\mathrm{f}}$

(2)

式中：C₀为目标分析物的初始浓度，单位mg/L；C_f为平衡吸附上清液中目标物的浓度，单位mg/L；V为添加的溶液体积，单位mL；M为聚合物的质量，单位mg；Q为吸附量，单位mg/g；K_D为分配系数，单位g/mL。

$I F=Q_{\mathrm{MIPs}} / Q_{\mathrm{NIP}}$

(3)

式中：IF为印迹因子；Q_MIPs为MIPs对5α-胆甾烷的吸附量，单位mg/g；Q_NIP为NIP对5α-胆甾烷的吸附量，单位mg/g。

其次，采用准一级动力学方程式(Pseudo-first order)(公式(4))和准二级动力学方程式(Pseudo-second order)(公式(5))模拟MIPs及NIP对5α-胆甾烷的吸附动力学过程^[25-29]：

$\ln \left(Q_{\mathrm{f}}-Q_t\right)=\ln Q_{\mathrm{f}}-K_1 t$

(4)

$t / Q_t=1 /\left(K_2 Q_{\mathrm{f}}^2\right)+t / Q_{\mathrm{f}}$

(5)

式中：Q_f为平衡时吸附量，单位mg/g；Q_t为测量时间t时的吸附量，单位mg/g；t为时间，单位min；K₁为准一级吸附动力学常数；K₂为准二级吸附动力学常数。

最后，采用Scatchard[公式(6)]、Langmuir[公式(7)]和Freundlich[公式(8)]等温模型研究吸附过程^[30]。

$Q_{\mathrm{f}} / C_{\mathrm{f}}=\left(Q_{\text {max }}-Q_{\mathrm{f}}\right) / K_{\mathrm{d}}$

(6)

$C_{\mathrm{f}} / Q_{\mathrm{f}}=C_{\mathrm{f}} / Q_{\text {max }}+1 /\left(K_{\mathrm{L}} Q_{\text {max }}\right)$

(7)

$\lg Q_{\mathrm{f}}=\lg K_{\mathrm{F}}+\frac{1}{n_{\mathrm{F}}} \lg C_{\mathrm{f}}$

(8)

式中：Q_max为最大表观吸附量，单位mg/g；K_d为结合位点的解离常数；K_L为Langmuir常数，单位L/mg；K_F为Freundlich常数；n_F为Freundlich模型强度。

2. 结果与讨论

2.1 MIPs聚合时间、温度以及交联剂配比优化

通过观察MIP1、MIP2、MIP3及NIP在不同聚合时间(12、16、20、24、28 h)下在聚合溶液中的表观变化情况，发现随着聚合时间的增加，溶液颜色由无色透明逐渐变为浑浊，之后转变为乳白色，12 h时聚合物沉淀颗粒数目迅速增多，其上清液为浑浊乳白色，16、20 h之后仍持续增多，在24 h时白色聚合颗粒物数目基本保持稳定，均匀贴于瓶底，上清液较澄清，到28 h后沉淀量及上清液透明程度保持不变。因此通过连续制备最终选择24 h为聚合反应的最佳时间。结合吸附实验探讨了不同温度下聚合物(MIP1、MIP2、MIP3)对5α-胆甾烷的吸附量变化。随着温度的升高，不同模板制备出的聚合物MIPs吸附量均在60 ℃时达到最高，到70℃时吸附量反而下降(图 3a)。因此，在接下来的实验中选用60 ℃为最佳聚合温度。在一定交联剂用量下，MIPs的吸附性能得到提高，通过实验发现当n(模板分子)∶n(AA)∶n(EGDMA)=1∶4∶20时(图 3b)，制备的胆固醇、去氧胆酸、β-谷固醇虚拟分子印迹聚合物MIP1、MIP2、MIP3的吸附量均最高，表明该条件下的MIPs具有最佳的识别性。

图 3 温度(a)和交联剂用量(b)对聚合物吸附性能的影响

Figure 3. Effects of temperatures (a) and cross-linking agent dosage (b) on adsorption performance of polymers

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2.2 MIPs表征(BET、SEM、红外、XRD)

(1) 如表 3所示，MIPs的比表面积、平均孔径和孔体积等参数均大于NIP。这表明MIPs合成过程中模板的存在，使聚合过程中形成了空腔，并有效地限制了孔穴的收缩，因此合成的MIPs具有比NIP更大的比表面积(图 4)。这也表明MIPs形成了一个互补的空间结构，用于MIPs对目标化合物的选择性识别。

表 3 MIPs和NIP的比表面积、孔径及孔体积

Table 3. BET specific surface area, pore size and pore volume of MIPs and NIP

性能	MIP1	MIP2	MIP3	NIP
比表面积/(m²/g)	4.612	3.422	2.649	2.408
平均孔径/nm	11.008	6.014	5.704	5.714
总孔体积/(cm³/g)	0.013	0.005	0.004	0.003

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图 4 MIPs和NIP的氮气吸附

Figure 4. Nitrogen adsorption of MIPs and NIP

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(2) 图 5为MIPs和NIP的扫描电镜图像。可以观察到印迹聚合物的形态特征，发现MIPs为形状和大小均匀的球形纳米颗粒。通过电镜扫描分析，可以看出MIP2的表面明显比NIP粗糙，呈现凹凸不平且十分不规则，这可能是由于随着模板分子的洗脱，聚合物的表面形成了许多的孔穴，该孔穴对于5α-胆甾烷具有很强的识别性，同时也大大增加了聚合物的比表面积，使得MIP2的吸附性能更为优异。

图 5 MIPs与NIP的SEM图像

Figure 5. SEM images of MIPs and NIP

a.MIP1;b.MIP2;c.MIP3;d.NIP。

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(3) 采用红外光谱表征MIPs和NIP的结构特性。如图 6所示，当N-H、O-H等与其他氢供体形成氢键时，3 500 cm^-1处的伸缩振动带移向较低频率，其化学键将会有所弱化。此外，分子印迹聚合物均具有3418cm^-1附近处羟基的特征峰，且2 964 cm^-1附近C-H键的伸缩振动峰较强，说明成功地合成了MIPs(图 6a)。

图 6 吸附前分子印迹聚合物的红外光谱(a)及XRD衍射图(b)

Figure 6. Infrared spectra (a) and XRD diffraction patterns (b) of pre-adsorption MIPs

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(4) 从聚合物MIP1、MIP2、MIP3以及NIP的广角射线衍射图中可以看出，MIP1聚合物的XRD图谱是宽的扩散峰，没有尖锐峰，所以MIP1聚合物在本质上是无定形的非结晶形态材料(图 6b)。

2.3 MIPs的特异性吸附性能

为了探究MIPs的吸附性能，通过平衡吸附实验，获得MIP1、MIP2、MIP3和NIP的吸附量(Q)、印迹因子(IF)和分配系数(K_D)(表 4)，发现MIPs的Q值、IF值及K_D值均大于NIP，表明MIPs对5α-胆甾烷的吸附能力均强于NIP，MIPs对5α-胆甾烷具有较高的亲和性和选择性。其原因主要在于5α-胆甾烷与虚拟模板分子结构相似，使得5α-胆甾烷选择性地被吸附在其特定的孔穴中，但非分子印迹聚合物是随机分布的，不能表现出特异的选择性。

表 4 MIPs和NIP的吸附量、印迹因子及分配系数

Table 4. Adsorption capacity, imprinting factors, and partition coefficients of MIPs and NIP

分子印迹聚合物	模板分子类型	Q/(mg/g)	IF	K_D/(g/mL)
MIP1	胆固醇	0.602 2	2.278 5	0.155 7
MIP2	去氧胆酸	0.718 3	2.717 7	0.191 0
MIP3	β-谷固醇	0.734 7	2.779 8	0.208 1
NIP		0.264 3		0.056 5

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2.4 动力学吸附过程

研究MIPs对5α-胆甾烷吸附量(Q_t)与时间(t)的关系，对于深入了解吸附量随时间的变化过程，包括最大吸附量和吸附平衡时间具有重要意义。通过静态吸附实验发现，对于5α-胆甾烷而言，MIP2和MIP3在前40 min内表现出快速吸附阶段，而MIP1则在前70 min内完成快速吸附。与此不同，NIP的快速吸附在前10 min内完成，但随着时间的增加，吸附速率逐渐减小。最终，MIPs和NIP的吸附量均在70 min左右达到平衡，MIP1、MIP2、MIP3及NIP的最大吸附量分别为0.635 2、0.717 9、0.701 5、0.338 5 mg/g(图 7a)，MIPs微球的吸附量在相同时间下均高于NIP微球，表明由于5α-胆甾烷经过洗脱后，保留了聚合物的空间和结构，即“印迹空穴”，当与模板分子相似的结构进入“空穴”后会产生特异性结合；而NIP在合成过程中不含有与模板分子结构相似的“空穴”，因此其吸附能力低于MIPs，这也说明MIPs中的选择性识别位点对5α-胆甾烷具有良好的亲和性和吸附能力^[31-32]。此外，由于NIP内部缺乏印迹空腔，NIP对5α-胆甾烷的吸附属于非特异性吸附。据报道，印迹过程可使MIPs形成与5α-胆甾烷分子空间排布相匹配的识别位点，在经过交联固定后，MIPs上的识别位点保留了记忆功能，当5α-胆甾烷靠近识别位点时，就会表现出较强的特异性识别能力；而NIP微球没有形成相匹配的识别位点，使得其吸附结合能力较弱。在初始阶段，5α-胆甾烷在MIPs微球上存在大量结合位点，传质阻力较低，5α-胆甾烷能迅速与MIPs微球的印迹空腔结合，使其在早期能更快地吸附到MIPs微球上。但随着吸附时间的增加，更多的5α-胆甾烷占据了微球上的结合位点，由于传质阻力对吸附速率的影响较大，要继续传送到聚合物内部的空穴需要花费更长时间，其吸附速率下降并逐渐趋于平衡。对照非分子印迹聚合物NIP，因其不具备特异选择性，且功能单体排列混乱，空穴少，导致达到平衡状态所需的时间少，吸附量小^[32]。因此在应用MIPs进行甾烷类化合物的分离富集时，实验时间可设定为70 min。

图 7 MIPs和NIP的吸附动力学曲线(a)和准二级动力学模型(b)

Figure 7. Adsorption kinetics curves (a) and pseudo-second-order kinetic models (b) of MIPs and NIP

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为了进一步探究沉淀聚合法制备的胆固醇、β-去氧胆酸、去氧胆酸虚拟MIPs的吸附过程及其潜在的速率控制步骤，需要对吸附动力学曲线模型进行拟合对比。准一、二级动力学方程式[公式(4)和(5)]吸附动力学拟合结果如图 7b所示，从结果可知MIP1、MIP2、MIP3和NIP的准一级动力学的相关系数R²分别为0.892、0.933、0.967、0.303，吸附速率常数K₁分别为0.104、0.157、0.169、0.269；准二级动力学的相关系数R²分别为0.999、0.998、0.999、0.998，吸附速率常数K₂分别为0.301、0.366、0.426、0.588(表 5)。对比准一级动力学模型和准二级动力学模型，发现准二级动力学模型可较好地拟合MIPs和NIP吸附5α-胆甾烷的动力学过程，其相关系数R²大于0.99，且计算得到的MIP1、MIP2、MIP3的平衡吸附量(Q_f)分别为0.645、0.689、0.717 mg/g，与实验值接近，由此证明MIPs和NIP的动力学吸附过程更符合准二级动力学模型。说明印迹空腔吸附和孔隙吸附是MIPs吸附5α-胆甾烷的主要作用原理^[33-34]。孔隙吸附一般偏向物理吸附，印迹孔洞是将动力学呈现二级特征的主要原因^[35]。综上所述，MIPs和NIP的吸附过程主要由化学吸附控制，主要表现为MIPs与5α-胆甾烷之间发生氢键作用。由图 8所示，MIPs吸附后在3 540 cm^-1附近O-H的振动峰比吸附前的波段宽，推测是由于氢键形成导致的，这主要是由5α-胆甾烷的C-H键与MIPs中的-OH和-COOH作用的结果。同时，吸附后MIPs和NIP在3 000~3 500 cm^-1和2 956 cm^-1左右处出现双峰，对应的是聚合物吸附后的甲基和亚甲基基团C-H的对称和非对称伸缩振动。

表 5 MIPs和NIP的准一级和准二级动力学参数

Table 5. Pseudo-first-order and pseudo-second-order kinetics parameters of MIPs and NIP

分子印迹聚合物	方程	R²	K	Q_f/(mg/g)
MIP1	准一级动力学方程	0.892	0.104	0.617
MIP1	准二级动力学方程	0.999	0.301	0.645
MIP2	准一级动力学方程	0.933	0.157	0.697
MIP2	准二级动力学方程	0.998	0.366	0.689
MIP3	准一级动力学方程	0.967	0.169	0.707
MIP3	准二级动力学方程	0.999	0.426	0.717
NIP	准一级动力学方程	0.303	0.269	0.339
NIP	准二级动力学方程	0.998	0.588	0.358

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图 8 MIPs和NIP吸附前后分子印迹聚合物的红外光谱

Figure 8. Infrared spectra of MIPs before and after MIPs and NIP adsorption

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2.5 等温吸附过程

研究吸附过程时需要考虑等温吸附，等温吸附可以准确地描述吸附质与吸附剂之间相互作用的过程^[36-38]。为了更详细地探究胆固醇、β-谷固醇和去氧胆酸虚拟MIPs以及NIP的吸附性能，开展25 ℃不同初始浓度(1.0~11 mg/L)下的吸附等温实验。实验结果(图 9)表明，MIP1、MIP2和MIP3在所有浓度范围内均表现出明显高于NIP的结合吸附能力。这一现象与动力学实验结果一致。值得注意的是，随着初始浓度的增加，这种吸附性能的差异逐渐加大，表明虚拟MIPs对5α-胆甾烷的高选择性吸附在更高浓度下变得更加显著。此外，MIPs的吸附量均在7.0 mg/L时吸附变缓，趋于平衡；5α-胆甾烷浓度为5.0 mg/L时，NIP的吸附量达到饱和状态，这说明与NIP相比，MIPs对5α-胆甾烷有较强的特异性选择结合能力。其原因在于MIPs制备过程中，模板分子的存在使得功能单体结构进行了有序的排列，且形成了规则的立体结构，当模板分子洗脱后，在聚合物内部形成了形状与5α-胆甾烷相匹配的空腔，使MIPs具有了良好的选择结合能力。但在NIP的制备过程中，由于模板分子不存在，使得功能单体配体的结合方向十分灵活，形成的空腔不具备规则性，进而导致NIP的选择吸附结合能力较差。

图 9 MIPs和NIP的等温吸附曲线(a)及Langmuir模型(b)

Figure 9. Isothermal adsorption curves (a) and Langmuir models (b) of MIPs and NIP

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目前在研究MIPs的吸附性能时，常采用Scat-chard模型来确定平衡键合位数目及键合常数，为了探索MIPs和NIP对5α-胆甾烷的吸附行为，采用Scatchard模型进行回归分析(表 6)，整体上，MIPs不是单一的线性曲线，而是由斜率不同的两个线性部分(MI和MII)组成(图 10a)，说明在5α-胆甾烷物质浓度为1.0~11.0 mg/L的范围内，MIPs微球中吸附位点不均匀，对5α-胆甾烷吸附存在两类吸附位点，即高亲和位点和低亲和位点^[39]。这是由于模板分子可能会影响MIPs的形成，进而使分子印迹聚合物形成不同特异性结合位点的异构体^[40]；或者可能由于聚合过程中溶液体系反应条件不均匀，使得模板分子与功能单体形成不同比例的配合物，从而使形成的非共价键作用位点分布不均匀^[41]；进而通过选择性差异、位点密度不均、结构异质性以及竞争效应等影响MIPs微球表面印迹孔穴位点分布。而NIP的Scatchard曲线呈线性关系分布(图 10a)，可能是因为NIP的结合位点具各向同性，没有印迹过程，只能形成一种类型的结合位点，因而对5α-胆甾烷的吸附是非选择性的。

表 6 MIPs和NIP的Scatchard、Freundlich、Langmuir模型方程

Table 6. Scatchard, Freundlich, and Langmuir models for MIPs and NIP

模型	参数		MIP1	MIP2	MIP3	NIP
Freundlich等温模型	R²		0.831	0.822	0.864	0.938
	n_F		2.309	2.558	2.859	3.233
	K_f		0.256	0.334	0.378	0.152
Langmuir等温模型	R²		0.922	0.930	0.929	0.986
	Q_m/(mg/g)		0.840	0.941	0.933	0.338
	K_L/(L/mg)		0.368	0.475	0.605	0.709
Scatchard等温模型	R²	MI	0.712	0.999	0.998	0.972
	R²	MII	0.967	0.926	0.953
	K_s/(L/mg)	MI	29.851	5.858	11.616	1.483
	K_s/(L/mg)	MII	0.347	0.074	0.272
	Q_m/(mg/g)	MI	5.054	1.957	2.918	0.343
	Q_m/(mg/g)	MII	0.636	0.750	0.744

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图 10 MIPs和NIP的Scatchard模型拟合(a)及吸附前后XRD分析(b)

Figure 10. Scatchard model fitting of MIPs and NIP (a) and XRD analysis before and after adsorption (b)

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为了进一步探讨MIPs和NIP的等温吸附行为，采用Langmuir和Freundlich吸附等温模型拟合等温吸附过程。通常，Langmuir模型主要用于评价材料表面的均匀吸附过程，而Freundlich模型则主要用于评价材料表面的非均匀吸附过程。由表 6可知，Langmuir模型的相关系数(R²)均大于Freund-lich模型的相关系数，说明MIPs和NIP对5α-胆甾烷的吸附过程更符合Langmuir模型，表明其均属于均匀的单分子层吸附，这与MIPs材料表面的分子印迹空穴位点分布均匀密切相关^[42]；同时XRD结果也证实了这一结论。此外，MIPs和NIP对5α-胆甾烷的等温吸附过程可用平衡参数(R_L)^[43]来评估，计算公式如下：

$R_{\mathrm{L}}=1 /\left(1+K_{\mathrm{L}} C_0\right)$

(9)

式中：C₀为吸附溶液的初始浓度，单位mg/L；K_L为吸附平衡常数，单位L/mg。当R_L=1时，表示线性的等温吸附；当R_L=0时，代表不可逆的等温吸附；当0 < R_L < 1时，表示有利的等温吸附；当R_L>1时，代表不适合的等温吸附印迹。MIPs和NIP在一系列浓度下的平衡参数R_L如表 7所示。可以看出，胆固醇、去氧胆酸、β-谷固醇虚拟分子印迹聚合物材料的R_L值均在0~1之间，表明在研究浓度范围(1~11 mg/L)内是有利于分子印迹聚合物吸附5α-胆甾烷的。

表 7 MIPs和NIP关于Langmuir方程的R_L值

Table 7. R_L values of MIPs and NIP in Langmuir equations

C₀/(mg/L)	R_L
C₀/(mg/L)	MIP1	MIP2	MIP3	NIP
1	0.731	0.623	0.678	0.585
3	0.475	0.355	0.413	0.319
5	0.352	0.249	0.297	0.219
7	0.279	0.191	0.231	0.168
9	0.232	0.155	0.189	0.135
11	0.198	0.131	0.161	0.114

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2.6 分子印迹聚合物分离甾烷化合物

基于MIPs柱对5α-胆甾烷的选择识别能力，评价了印迹柱对原油饱和烃组分中甾烷的分离能力及实际应用。使用柱分离及GC-MS分析了MIP1吸附前后的淋洗液和洗脱液。如图 11所示，MIP1对甾烷的吸附量要高于其他组分，几乎没有杂质峰干扰，初步实现了甾烷分离，达到了富集目标化合物的预期目标，可用于原油样品中甾烷的分离提纯。

图 11 MIP1洗脱甾烷前后GC-MS色谱

Figure 11. GC-MS chromatograms of MIP1 before and after elution of steroids

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3. 结论

(1) 通过优化MIPs聚合条件，可知合成分子印迹聚合物的最佳聚合时间为24 h，最佳聚合温度为60 ℃，最优交联剂配比为n(模板分子)∶n(AA)∶n(EGDMA)=1∶4∶20。扫描电镜结果显示聚合物为球形纳米颗粒，以纳米为单位，具有均匀的尺寸，且MIPs的比表面积均大于NIP；MIPs的傅里叶红外光谱图中官能团发生变化，说明分子印迹聚合物(MIPs)制备成功。

(2) 吸附动力学结果表明，MIPs对5α-胆甾烷的吸附量在相同时间内均大于NIP，表明MIPs具有吸附选择特异性。准一级动力学模型和准二级动力学模型拟合结果发现，MIPs更符合准二级动力学模型，主要受化学吸附控制，且MIPs与5α-胆甾烷发生了氢键作用。

(3) 吸附等温线结果发现，当5α-胆甾烷的浓度均为7.0 mg/L时，MIPs的吸附量达到饱和状态，且明显高于NIP。同时，MIPs和NIP更符合Langmuir等温吸附模型，表明MIPs对5α-胆甾烷的吸附过程属于单分子层均匀吸附。根据平衡参数0 < R_L < 1，说明形成的MIPs在1~11 mg/L浓度范围内有利于5α-胆甾烷的吸附。实际样品实验结果表明，胆固醇分子印迹聚合物对甾烷类物质具有较好的分离纯化能力。

(4) 胆固醇、去氧胆酸、β-谷固醇三种虚拟分子印迹聚合物均对5α-胆甾烷具有较高的分子识别能力及选择性，并对甾烷类物质具有较好的分离能力。分子印迹技术为深层—超深层原油中微量甾烷类化合物的分离富集寻找了一条新的途径，也为开拓分子印迹聚合物的应用研究提供了良好的理论和实验基础。

利益冲突声明/Conflict of Interests

所有作者声明不存在利益冲突。

All authors disclose no relevant conflict of interests.

作者贡献/Authors’Contributions

原陇苗参与实验设计；陈建珍和马荣完成实验操作；原陇苗、邵媛媛和吴应琴参与论文写作与修改。所有作者均阅读并同意最终稿件的提交。

The study was designed by YUAN Longmiao. The experimental operation was completed by CHEN Jianzhen and MA Rong. The manuscript was drafted and revised by YUAN Longmiao, SHAO Yuanyuan, and WU Yingqin. All authors have read the last version of the paper and consented to its submission.

图 1 分子印迹聚合物的聚合方案

Figure 1. Polymerization scheme for MIPs

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图 2 分子印迹聚合物对甾烷类物质的分离及纯化

Figure 2. Isolation and purification of steroidal compounds by MIPs

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图 3 温度(a)和交联剂用量(b)对聚合物吸附性能的影响

Figure 3. Effects of temperatures (a) and cross-linking agent dosage (b) on adsorption performance of polymers

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图 4 MIPs和NIP的氮气吸附

Figure 4. Nitrogen adsorption of MIPs and NIP

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图 5 MIPs与NIP的SEM图像

Figure 5. SEM images of MIPs and NIP

a.MIP1;b.MIP2;c.MIP3;d.NIP。

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图 6 吸附前分子印迹聚合物的红外光谱(a)及XRD衍射图(b)

Figure 6. Infrared spectra (a) and XRD diffraction patterns (b) of pre-adsorption MIPs

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图 7 MIPs和NIP的吸附动力学曲线(a)和准二级动力学模型(b)

Figure 7. Adsorption kinetics curves (a) and pseudo-second-order kinetic models (b) of MIPs and NIP

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图 8 MIPs和NIP吸附前后分子印迹聚合物的红外光谱

Figure 8. Infrared spectra of MIPs before and after MIPs and NIP adsorption

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图 9 MIPs和NIP的等温吸附曲线(a)及Langmuir模型(b)

Figure 9. Isothermal adsorption curves (a) and Langmuir models (b) of MIPs and NIP

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图 10 MIPs和NIP的Scatchard模型拟合(a)及吸附前后XRD分析(b)

Figure 10. Scatchard model fitting of MIPs and NIP (a) and XRD analysis before and after adsorption (b)

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图 11 MIP1洗脱甾烷前后GC-MS色谱

Figure 11. GC-MS chromatograms of MIP1 before and after elution of steroids

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表 1 实验试剂

Table 1. Experimental reagents

表 2 实验仪器

Table 2. Experimental apparatus

实验仪器	型号	生产厂家
紫外可见光度计	UV-2600	谱质分析检测技术(上海)有限公司
电热恒温干燥箱	XMA-2000	泰科施普(北京)技术有限公司
恒温培养振荡器	HNY-100β	天津市欧诺仪器仪表有限公司
超声波清洗器	KQ5200 E	昆山市超声仪器有限公司
傅里叶红外光谱仪	Bruker Alpha	泰科施普(北京)技术有限公司
场发射扫描电子显微镜	Merlin Compact	德国蔡司
GC-MS	HP Agilent 6890/5737	美国安捷伦科技有限公司

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表 3 MIPs和NIP的比表面积、孔径及孔体积

Table 3. BET specific surface area, pore size and pore volume of MIPs and NIP

性能	MIP1	MIP2	MIP3	NIP
比表面积/(m²/g)	4.612	3.422	2.649	2.408
平均孔径/nm	11.008	6.014	5.704	5.714
总孔体积/(cm³/g)	0.013	0.005	0.004	0.003

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表 4 MIPs和NIP的吸附量、印迹因子及分配系数

Table 4. Adsorption capacity, imprinting factors, and partition coefficients of MIPs and NIP

分子印迹聚合物	模板分子类型	Q/(mg/g)	IF	K_D/(g/mL)
MIP1	胆固醇	0.602 2	2.278 5	0.155 7
MIP2	去氧胆酸	0.718 3	2.717 7	0.191 0
MIP3	β-谷固醇	0.734 7	2.779 8	0.208 1
NIP		0.264 3		0.056 5

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表 5 MIPs和NIP的准一级和准二级动力学参数

Table 5. Pseudo-first-order and pseudo-second-order kinetics parameters of MIPs and NIP

分子印迹聚合物	方程	R²	K	Q_f/(mg/g)
MIP1	准一级动力学方程	0.892	0.104	0.617
MIP1	准二级动力学方程	0.999	0.301	0.645
MIP2	准一级动力学方程	0.933	0.157	0.697
MIP2	准二级动力学方程	0.998	0.366	0.689
MIP3	准一级动力学方程	0.967	0.169	0.707
MIP3	准二级动力学方程	0.999	0.426	0.717
NIP	准一级动力学方程	0.303	0.269	0.339
NIP	准二级动力学方程	0.998	0.588	0.358

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表 6 MIPs和NIP的Scatchard、Freundlich、Langmuir模型方程

Table 6. Scatchard, Freundlich, and Langmuir models for MIPs and NIP

模型	参数		MIP1	MIP2	MIP3	NIP
Freundlich等温模型	R²		0.831	0.822	0.864	0.938
	n_F		2.309	2.558	2.859	3.233
	K_f		0.256	0.334	0.378	0.152
Langmuir等温模型	R²		0.922	0.930	0.929	0.986
	Q_m/(mg/g)		0.840	0.941	0.933	0.338
	K_L/(L/mg)		0.368	0.475	0.605	0.709
Scatchard等温模型	R²	MI	0.712	0.999	0.998	0.972
	R²	MII	0.967	0.926	0.953
	K_s/(L/mg)	MI	29.851	5.858	11.616	1.483
	K_s/(L/mg)	MII	0.347	0.074	0.272
	Q_m/(mg/g)	MI	5.054	1.957	2.918	0.343
	Q_m/(mg/g)	MII	0.636	0.750	0.744

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表 7 MIPs和NIP关于Langmuir方程的R_L值

Table 7. R_L values of MIPs and NIP in Langmuir equations

C₀/(mg/L)	R_L
C₀/(mg/L)	MIP1	MIP2	MIP3	NIP
1	0.731	0.623	0.678	0.585
3	0.475	0.355	0.413	0.319
5	0.352	0.249	0.297	0.219
7	0.279	0.191	0.231	0.168
9	0.232	0.155	0.189	0.135
11	0.198	0.131	0.161	0.114

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