Microbial characteristics of low-amplitude structures and prediction of favorable target areas in Xinhe area, Tarim Basin
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摘要: 对塔里木盆地新和地区油气微生物异常特征进行了研究，为该地区油气预测和油气微生物勘探技术的推广和应用提供依据。主要采用平板培养计数法、16SrRNA基因克隆文库法与高通量测序法对土壤样品中的油气微生物进行定量检测，利用这些方法研究了新和地区油气微生物种群构成及数量异常情况，构建出研究区油气区的油气微生物异常模式。以此为依据，对新和及三道桥地区低幅度圈闭线索区域的油气微生物进行检测，根据油气微生物异常特征预测油气有利区。最终识别出5个微生物异常区，并结合构造圈闭认识结果及油气微生物数量异常，优选出5个潜在的有利勘探目标区。Abstract: The Microbial Prospecting for Oil and Gas (MPOG) is an exploration method based on the seepage of light gaseous hydrocarbons from oil/gas reservoirs to the surface and their utilization by hydrocarbon oxidizing bacteria. By studying the abnormal characteristics of oil and gas microorganisms in Xinhe area of the Tarim Basin, this project provides a solid scientific basis for oil and gas prediction and the validation and application of oil and gas microbial exploration technology in this area. Soil samples were collected to investigate prospects for hydrocarbon exploration. The amount of cultivable soil microorganisms in different soil samples were analyzed using the agar plating method. High-throughput sequencing has been used directly to study the composition of microbial population in soil samples. Based on the data from Xinhe area, an abnormal pattern of oil and gas microorganisms has been established. By using this pattern, five abnormal microbial areas were identified in the Xinhe and Sandaoqiao area. Combined with the results of structural traps and the abnormal number of hydrocarbon microorganisms, five potential favorable exploration target areas were identified.
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油气微生物勘探技术MPOG(Microbial Prospecting for Oil and Gas)是一种地表勘探技术，主要研究近地表土壤层中微生物异常与地下深部油气藏的分布关系，可以预测油气分布。油气微生物勘探利用地表土壤或沉积物样品中烃氧化菌分布的异常，这种异常反映了来源于其正下方深部封存的油气藏的高丰度连续烃的供给，因此能够探测出深部地层中含油气分布区，具有直接、有效、多解性小和经济效益好等优势，对预测地下油气藏分布具有良好的指示效果。在我国剩余待发现的油气资源呈现出以非构造油气藏为主，且小规模呈分散分布特征的情况下，该技术作为大范围地区油气区初筛方法，在油气勘探领域越来越受到重视。油气微生物勘探技术是地表地球化学勘探技术的一个分支，已在许多国家和地区得到应用，取得了显著成效[1-2]。据美国相关公司报道，在全球范围内采用油气微生物勘探技术的平均钻探成功率达到80%，该技术已经成为生物学技术在油气勘探领域开拓性的应用[3-5]。
油气微生物勘探技术的原理是[6-11]：在油气藏压力的驱动下，埋藏在地下深处的油气藏向地表持续释放出轻烃气，这些轻烃气持续向地表扩散和运移，土壤中的专性微生物以轻烃气为其唯一能量来源，在油藏正上方的地表土壤中发育并形成微生物异常，通过合适的微生物技术，检测微生物异常，就可以预测下伏油气藏的存在及其油气藏的性质。目前研究较多的以轻烃气为能量来源的油气指示菌有甲烷氧化菌和丁烷氧化菌，甲烷氧化菌在天然油气田或人工气田附近的近地表土壤大量分布，可作为油气藏勘探指标之一[12-16]。丁烷氧化菌受人为影响较小，主要来源于油气藏，因此认为采用丁烷氧化菌作为研究对象对油气勘探更具有专属性。目前已在全球多个国家和地区完成了3 000多个项目，取得了巨大的成果，并沿用至今[15-16]。
1. 背景及问题
新和地区构造位置位于塔里木盆地沙雅隆起雅克拉断凸西端(图 1)，雅克拉断凸长期处于沙雅隆起的高部位，是库车坳陷三叠系—侏罗系油气运移指向区。新和地区目前已发现XH5井油气藏，英买油气藏，三道桥气藏等多个油气藏。研究区经历多期构造运动，纵向分为前中生界和中新生界2大构造层。前中生界侵蚀面以上为白垩系—第四系，总体表现为北倾单斜；前中生界侵蚀面以下主要为寒武系—前震旦系，寒武系—震旦系向北上倾，在工区中南部逐层尖灭。研究区断裂极为发育，存在着北东向、北北东向、北北西向3大组系，以北东向为主。在此构造背景下，中新生界主要存在背斜型(或断背斜型)、地层超覆型、岩性尖灭型圈闭类型，油源主要来自于三叠系—侏罗系生油岩，油气沿前中生界侵蚀面和断至前中生界侵蚀面的张性断层运移至中新生界的砂岩储层圈闭成藏；前中生界侵蚀面之下主要有潜山油气藏和内幕背斜油气藏2大类，陆相和海相油气沿前中生界侵蚀面运移至潜山圈闭聚集成藏。
新和地区油气成藏条件有利，圈闭类型多样，前期钻井证实圈闭是否落实是本区油气勘探的关键。目前，XH5井在低幅度构造圈闭领域获得油气，同时在新和—三道桥地区也落实了一些构造圈闭线索，但是由于埋深大，圈闭幅度小，现有技术落实圈闭难度大，造成前期钻井有成功也有失利，给油气分布预测评价带来极大难度。鉴于此，本文从油气微生物勘探角度出发，通过研究XH5井油气微生物异常特征，充分认识该区油气藏上方的油气微生物异常分布特点，构建油气区微生物异常模式，进而对新和及三道桥的多个低幅度构造圈闭线索的微生物异常进行分析，以期能够缩小油气勘探范围，推测有利区。
2. 样品采集及测试
2.1 样品采集
研究区土壤样品采集部署如图 1所示。针对圈闭进行十字线取样，点间距为500 m，总计部署采样点48个(表 1)。采集深度为90 cm，样品重量约200 g左右，采样完成后土壤样品用无菌袋密封放入低温储藏箱保存。
表 1 塔里木盆地新和地区采样点信息Table 1. Sample information in Xinhe area, Tarim Basin采样点 油气成藏 圈闭(位置见图 1) 地表环境 高通量分组 1-9号 近XH5井，油气已知区 圈闭0 农田 XH-y 10~13号 油气预测区 圈闭1 沙漠 XH-s 14~18号，44~48号 油气预测区 圈闭2 沙漠 XH-s 34~43号 油气预测区 圈闭3 果树 XH-gs 19~21号 油气预测区 圈闭4 农田 XH-nt 22~30号 油气预测区 圈闭5 农田 XH-nt 31~33号 油气预测区 圈闭6 农田 XH-nt 2.2 平板培养的方法和流程
将土壤样品加入5 mL无菌磷酸盐缓冲液，涡旋混匀，梯度稀释后涂布平板，然后将培养皿倒置于恒温培养箱中，抽出培养箱中约一半体积的空气，充入等体积的甲烷气体(丁烷氧化菌固体培养基中加入丁醇)，将密封后的培养箱置于30 ℃恒温室内培养，3天后菌落计数。
2.3 高通量测序
将土壤样品按照FastDNA SPIN Kit for Soil (MP Biomedicals，Santa Ana，CA)试剂盒提取DNA，通过微量紫外分光光度计(NanoDrop ND-1000UV)测定DNA浓度和纯度(OD260 nm/OD280 nm和OD260 nm/OD230 nm)，并利用琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量和完整性。
提取出的DNA，利用细菌16S rRNA基因的通用引物515F(GTGCCAGCMGCCGCGG)与907R(CCGTCAATTCMTTTRAGTTT)扩增其V3-V4区基因片段，在诺禾致源公司Illumina HiSeq测序平台上，利用双末端测序对小片段文库进行检测。将测序的reads拼接过滤，得到OTUs (Operational Taxonomic Units)聚类，统计每个样品注释到各分类水平(界、门、纲、目、科、属、种)上的序列数目，明确各分类水平的整体注释情况。并进一步通过α多样性分析(Alpha Diversity)及β多样性分析(Beta Diversity)研究样品间差异[17-18]。
3. 油气微生物异常特征及有利区预测
本文首先分析了XH5井(已知区)上方土壤样品中油气微生物的数量及种群异常分布特征，得到该区油气微生物的分布规律。鉴于XH5井与其东北方向(未知区，1~6号圈闭)构造、储层、主控因素和富集模式上都类似，所以我们通过将未知区的土壤样品与XH5井土壤样品中油气微生物进行比较，就可以筛选出未知区微生物异常的样品，进而对未知区进行预测。
3.1 XH5井及未知区圈闭油气微生物数量异常特征
采用平板培养法研究已知区和未知区油气微生物的数量异常。本文对油气微生物数量异常的研究主要集中在丁烷氧化菌与甲烷氧化菌2种利用轻烃作为碳源的油气指示菌。这2种细菌能够利用甲烷或者丁醇作为唯一的碳源进行正常的生理代谢活动，是油气藏上方近地表土壤中相对富集的菌种。通过对定量土壤中细菌的分离、稀释及平板培养，可以得出每毫克土壤中甲烷氧化菌或丁烷氧化菌的数量，从而指示不同土壤中油气指示菌的数量差异。结果显示，在XH5井上方细菌数量明显高于背景区(非油气区)。甲烷氧化菌和丁烷氧化菌均呈现出高异常，且高度对应，甲烷氧化菌含量较高的土壤样品往往丁烷氧化菌含量也较高(图 2)。油气区的甲烷、丁烷氧化菌数量较高为油气异常模式之一。
图 2 塔里木盆地新和地区XH5井东北向采样线油藏剖面与微生物数量异常对应关系圈闭位置见图 1。Figure 2. NE-oriented geological section crossing well XH5 in Xinhe area of Tarim Basin and correspondence with microbial quantity根据已知区得到的油气微生物数量异常模式，进一步针对XH5井东北方的6个圈闭线索进行微生物数量异常研究，以此做出相应的地质剖面与油气微生物数量异常关系图(图 2)，发现部分圈闭上方的部分土壤样品甲烷、丁烷氧化菌数量较高，提示这些氧化菌数量较高的区域可能是油气有利区。
3.2 XH5井及未知区圈闭油气微生物种群异常研究
在对甲烷、丁烷氧化菌进行培养时发现，尽管利用甲烷或丁醇作为唯一的碳源进行筛选，培养出的细菌数量仍然与土壤肥力有着密切联系。新和地区土壤样品多来自农田林地等，也有少部分来自沙土地区，沙土地区的土壤样品中微生物数量明显低于农田或林地，考虑到土壤肥力高的样品微生物含量基数大于沙土地区，此结果符合预期，但是这对于利用油气微生物数量异常进行勘探提出了挑战。因为XH5井主要是农田，在对沙漠地形的未知区域进行勘探时往往不能得到准确的结果，因此需要配合微生物种群异常研究，采用免培养的高通量测序方法。
为了在研究微生物种群异常的基础上进一步分析土壤条件对油气微生物的影响，对新和已知区(XH5井)及未知区的土壤样品进行分组。XH5井油气区样品为一组(XH-y)，农田未知区样品为一组(XH-nt)，果树未知区样品为一组(XH-gs)，沙土未知区样品为一组(XH-s)(表 1)。通过对土壤样品中的DNA进行测序分析，得到物种累计曲线图(图 3)，由图 3可知DNA含量能够准确指示土壤中微生物种群分布情况。
图 3 塔里木盆地新和地区土壤样品物种累计曲线Figure 3. Species accumulation curve in Xinhe area, Tarim Basin根据所有样品在属水平的丰度信息，选取占比最高的前50的属，根据其在每个样品中的比例，绘制成聚类热图(图 4)。由于直接提取土壤样品中的所有微生物的DNA进行检测，并未如培养法中加入甲烷或丁醇作为唯一碳源筛选，因此所得到的数据反映了土壤中群落构成的真实情况。而其中有很大一部分菌种并非油气指示菌种，或者有的菌种是否能指示油气还未被鉴定，因此即使在油气区占比高的菌种也并非一定为油气指示菌，有可能只是因为该地的土壤条件导致某一种或几种菌较为富集。综上，在分析时应着重分析已知具有油气指示作用的细菌占比。
图 4 塔里木盆地新和地区物种属水平丰度聚类热图Figure 4. Heat map of species abundance at the genus level in Xinhe area, Tarim Basin通过对XH-y组样品中微生物种群构成的分析，发现在XH5井上方及周边样品中拟杆菌属、瘤胃菌属、诺卡氏菌属和假单胞菌属占有较高比例，占到80%以上。其中诺卡氏菌属和假单胞菌属在其他已知油气地区也检测到并作为油气指示菌，而拟杆菌属和瘤胃菌属虽然在部分样品中占比达70%以上，但是此前并未作为油气指示菌被报道过，因此可能是由于地表条件造成这2种菌的富集，目前还不能作为油气指示菌。在后续的比较中我们着重分析与油气区菌群构成相似而且诺卡氏菌和假单胞菌含量较高的样品。
以此油气区构建的模式，将其他未知区样品的微生物种群组成与此模式进行比对分析。油气区(XH-y组)的样品之间同样存在差异，其中XH5井上方的样品聚集，证明其种群构成极为相似，而油气井周边的部分样品则存在一定差异。农田XH-nt和果树XH-gs两组均有部分样品与油气区种群构成接近，而部分样品差异较大。XH-y、XH-nt和XH-gs三组的土壤肥力较为接近，非油气指示菌的富集情况相对接近，因此，与油气区种群构成相近的样品下方含油气的可能性较大。XH-s组的样品虽然土壤肥力与其他三组相差较大，但仍有样品的微生物组成与油气区相似度较高，且诺卡氏菌含量较高，同样存在含油气的可能性。
通过聚类分析，在优势菌属的分布上对油气有利区进行初步筛选。由于新和地区样品除了XH5井上方样品可作为阳性对照，其他样品均为未知区，没有严格意义的阴性对照。为了完善分析，同时为了从菌群整体构成上研究不同环境中土壤样品的相似性或差异性，我们进一步做主坐标分析(Principal Coordinate Analysis，PCoA)。如图 5所示，不同颜色区分不同的组，每个点代表一个样品。通过分析与XH-y组样品距离接近的样品点，可以选定潜在的油气有利区样品；而与油气区距离相差较大的点，如果其油气指示菌含量(诺卡氏菌/假单胞菌)也很低，很有可能没有油气存在，通过这一原则对有利区预测提供依据。根据图 5所知，果树区与农田区种群构成极为接近，且分布较为集中，主要由于这些地区土壤肥沃，因此部分菌群大量增殖且聚集，对有利区预测造成一定的干扰，仍需进一步分析。
图 5 塔里木盆地新和地区物种主坐标分析(PCoA)Figure 5. Principal Component Analysis at genus level in Xinhe area, Tarim Basin为了更加直观地描述和比较多个样品间的相似性和差异关系，我们使用UPGMA(Unweighted Pair Group Method with Arithmetic mean) 聚类方法进行分析构建了进化树。首先将距离最小的2个样品聚在一起，并形成一个新的节点(新的样品)，其分支点位于2个样品间距离的1/2处；然后计算新的“样品”与其他样品间的平均距离，再找出其中的最小2个样品进行聚类；如此反复，直到所有的样品都聚到一起，最终得到一个完整的聚类树(图 6)。根据图 6中结果，可以更加直观地分析每个样品与已知油气区样品微生物种群构成的相似度。沙漠地区样品虽然在微生物数量上与其他几个组的样品差异较大，但是在此聚类方法分析的过程中发现多个样品点与油气区类似。分析得到沙漠区11、12、13、18和46号为潜在油气点；果树区40、42号为潜在油气点；农田区25、27号为潜在油气点。
图 6 塔里木盆地新和地区物种树状图(UPGMA/PGMA)Figure 6. Unweighted (a) or weighted (b) pair group method with arithmetic mean, Xinhe area, Tarim Basin3.3 新和地区油气有利区预测
新和地区主要是潜山—披覆低幅度背斜构造，XH5井天然气产量较高，结合该地区石油地质条件分析，利用构建的油气微生物异常特征，对新和及三道桥多个圈闭进行了含油气预测(图 7和图 8虚线圈定部分为预测的有利区)。
图 7 塔里木盆地新和地区XH5井东北方油气异常区(预测)Figure 7. Predicted oil and gas anomalous area to the northeast of well XH5 in Xinhe area, Tarim Basin利用油气微生物异常特征进行预测，主要结合微生物数量异常及种群构成异常，通过计算每个样品获得一个微生物数量异常值及种群异常值。其中数量异常值的算法如下：将XH5井上方样品在筛选条件下可培养的微生物数量平均值设置为1，其他未知区的样品点微生物数量与XH5井相比后得到一个异常值(例如未知样品点的可培养油气指示菌的数量是XH5井的1.5倍，则其异常值为1.5；如果数量是XH5井的0.2，则其异常值为0.2)。
样品点的油气指示菌种群异常值算法如下：将XH5井上方样品点作为标准点，其他未知区样品点高通量测序分析所得的种群亲缘关系及组成与标准点的差异可分配一个-1~0之间的值，即差异越小越接近0。
样品点总异常值为数量异常与种群异常值相加的结果，结果大于1的为高异常样品，含油气可能性较大；结果在0.5~1之间的为异常区，有含油气可能性；结果低于0.5的含油气可能性较低。异常及高异常样品点以及对应异常值如表 2所示。
表 2 塔里木盆地新和地区微生物异常样品点及异常值Table 2. Abnormal sample points and abnormal values in Xinhe area, Tarim Basin高异常样品点号 数量异常值 种群异常值 异常值总和 异常样品点号 数量异常值 种群异常值 异常值总和 11 1.025 -0.012 1.013 12 0.675 -0.025 0.650 27 1.565 -0.153 1.412 35 0.585 -0.036 0.549 40 2.145 -0.347 1.798 32 1.525 -0.824 0.701 46 1.845 -0.326 1.519 XH5井所在为0号圈闭，对其东北方向1~3号圈闭进行预测。结果显示，1号圈闭范围较小，检测到明显的异常，与微生物数量异常对应；2号圈闭西半部分检测到微生物异常，但是东部未见圈闭异常，可能由于圈闭不充盈导致；3号圈闭东北部分出现异常，圈闭其他部分上方土壤未检测到微生物异常(图 7)。
在三道桥地区，4号圈闭未见微生物异常，4号圈闭所处部位断裂发育，可能对圈闭有效性起到破坏作用，因此未检测到微生物异常；5号圈闭北部微生物异常明显，南部异常程度较低，但是仍然高于背景区；6号圈闭东部存在异常(图 8)。
4. 结论
(1) 建立了新和地区微生物数量与种群异常模式和油气藏的对应关系。已知油藏XH5井区地表甲烷氧化菌和丁烷氧化菌表现为明显的数量异常，对石油地质条件类似的几个低幅度构造圈闭线索的微生物菌落数量和种群进行了研究，识别出5个微生物异常区，预测为潜在的油气有利区。
(2) 建立了新和地区综合考虑微生物数量异常和种群异常的微生物油气检测判断标准。由于研究区地表条件多样，沙漠、农田、果林地区不同的土壤条件对实验结果有影响。研究使用特异的针对甲烷氧化菌和丁烷氧化菌的培养基，一定程度上排除了杂菌的影响，同时进行高通量测序技术对微生物种群构成进行分析，发现样品中微生物种群的总体构成以及某几种油气指示菌的比例都能够一定程度上反映油气情况。采用油气微生物的数量和种群两种指标进行检测，并相互参考，可排除假阳性和假阴性的结果，为油气微生物异常的检测奠定了基础。
(3) 油气微生物检测技术对新和地区油气勘探具有一定的指导意义。但由于地表因素和轻烃微渗漏的复杂性，在实际运用过程中，微生物数量、种群异常需要结合物探及钻井资料，多方法相结合进行油气有利区预测。
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图 2 塔里木盆地新和地区XH5井东北向采样线油藏剖面与微生物数量异常对应关系
圈闭位置见图 1。
Figure 2. NE-oriented geological section crossing well XH5 in Xinhe area of Tarim Basin and correspondence with microbial quantity
图 3 塔里木盆地新和地区土壤样品物种累计曲线
Figure 3. Species accumulation curve in Xinhe area, Tarim Basin
图 4 塔里木盆地新和地区物种属水平丰度聚类热图
Figure 4. Heat map of species abundance at the genus level in Xinhe area, Tarim Basin
图 5 塔里木盆地新和地区物种主坐标分析(PCoA)
Figure 5. Principal Component Analysis at genus level in Xinhe area, Tarim Basin
图 6 塔里木盆地新和地区物种树状图(UPGMA/PGMA)
Figure 6. Unweighted (a) or weighted (b) pair group method with arithmetic mean, Xinhe area, Tarim Basin
图 7 塔里木盆地新和地区XH5井东北方油气异常区(预测)
Figure 7. Predicted oil and gas anomalous area to the northeast of well XH5 in Xinhe area, Tarim Basin
表 1 塔里木盆地新和地区采样点信息
Table 1. Sample information in Xinhe area, Tarim Basin
采样点 油气成藏 圈闭(位置见图 1) 地表环境 高通量分组 1-9号 近XH5井，油气已知区 圈闭0 农田 XH-y 10~13号 油气预测区 圈闭1 沙漠 XH-s 14~18号，44~48号 油气预测区 圈闭2 沙漠 XH-s 34~43号 油气预测区 圈闭3 果树 XH-gs 19~21号 油气预测区 圈闭4 农田 XH-nt 22~30号 油气预测区 圈闭5 农田 XH-nt 31~33号 油气预测区 圈闭6 农田 XH-nt 
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表 2 塔里木盆地新和地区微生物异常样品点及异常值
Table 2. Abnormal sample points and abnormal values in Xinhe area, Tarim Basin
高异常样品点号 数量异常值 种群异常值 异常值总和 异常样品点号 数量异常值 种群异常值 异常值总和 11 1.025 -0.012 1.013 12 0.675 -0.025 0.650 27 1.565 -0.153 1.412 35 0.585 -0.036 0.549 40 2.145 -0.347 1.798 32 1.525 -0.824 0.701 46 1.845 -0.326 1.519
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